Betiltva: A COVID Észak-Karolinában kezdődött, nem Wuhanban

A cikk megírása óta elkezdtük megvizsgálni az amerikai nukleáris/bio/kémiai vállalkozó, Kushner-Trump kedvence, a Battelle, és titkos laboratóriumainak világszerte zajló működését.

Amikor elkezdtük, embereinket kezdték fenyegetni. Ez súlyos hiba volt.

Az alábbi dokumentumokból kiderül, hogy a COVID 19 létrehozására irányuló kutatás 2006-ban kezdődött az Egyesült Államokban, és 2015-ben egy sikeres biofegyverben csúcsosodott ki, az Észak-Karolinai Egyetemen és a Harvardon, valamint az Élelmiszer- és Gyógyszerügyi Hivatal arkansasi laboratóriumában végzett munkával.

Munkájuknak a következő címet adták:

A keringő denevér-koronavírusok SARS-szerű klasztere potenciális lehetőséget mutat az emberi megjelenésre
Ezt tették, és még sokkal, de sokkal többet is, ahogyan az alábbiakban olvashatják.

Ahogy Trump mondta, újra és újra és újra, a kínaiak is benne voltak.

A Kínai Tudományos Akadémia Wuhan-i Virológiai Intézetének, a Kínai Tudományos Akadémiának a speciális kórokozókkal és biológiai biztonsággal foglalkozó kulcsfontosságú laboratóriuma (Wuhan, Kína) szállította a Wuhan denevérvírust, amelyet az amerikai tanulmányban használtak. Az ő nevük csak emiatt szerepel.

A COVID 19 az amerikai hadsereg biofegyver-projektje volt, amelynek célja egy olyan tüdőgyulladást okozó betegség előállítása volt, amely ellen 40 év feletti betegeknél szinte lehetetlen lenne védőoltást alkalmazni.
A bizonyíték itt van, egyszerűen görgessen lefelé. A tanulmányt az Észak-Karolinai Egyetem vezette, és az USAID/CIA finanszírozta. Egy kínai denevérvírust választott, és úgy döntött, hogy egy wuhani egészségügyi intézményt is bevon.

Most már tudjuk, hogy miért, egy füstölgő álca a hibáztatás egy olyan programért, amihez Kínának alig vagy egyáltalán semmi köze nem volt, valami sátáni gonosz és tisztán amerikai.

2015 novemberében egy tanulmányt tettek közzé, amely felvázolta a mostani vírus előállításának lehetőségét. A sok érintett között volt egy laboratórium a kínai Wuhanban. A kezdetektől fogva úgy szerepelt, mint a tucatnyi, többnyire amerikai, ezen a projekten dolgozó laboratórium egyike.

Egy kulcsfontosságú résztvevő azonban kimaradt, az USAID. Mélyen gyanítható, hogy az USAID az amerikai biológiai hadviselési kutatások fedőszerve, mint amilyeneket a grúziai Tbilisziben és máshol folytatnak, és amelyekről sok dokumentumot találtunk. Ez az idézet az USAID-t is hozzáadja a kutatást finanszírozó csoporthoz.

2015. november 20.
A cikk eredetileg online közzétett változatában a szerzők elmulasztották feltüntetni egy finanszírozási forrást, az USAID-EPT-PREDICT finanszírozást az EcoHealth Alliance-tól Z.-L.S. A hibát kijavították a cikk nyomtatott, PDF és HTML változatában.

[ A szerkesztő megjegyzése: Most bemutatjuk a Pravda elfogult cikkét, alatta pedig a COVID 19 előállítási képességét bizonyító tényleges tanulmányt, amely egyszer s mindenkorra bebizonyítja, hogy nem egy természetesen előforduló vírusról van szó.

Az, hogy ki mit csinált, nem a mi dolgunk, de kategorikusan bizonyítjuk, hogy amikor egy kínai laboratóriumot említenek, az egy amerikai erőfeszítés kisebbik szereplője, ahogyan azt alább kimerítően ismertetjük.

Ezáltal a wuhani laboratórium megvitatása valószínűleg bűnrészessé válik a biológiai hadviselésben.

Hasonlóképpen, amikor a Forbes Magazine és mások azt állították, hogy bizonyítani tudják, hogy a COVID 19 természetes úton készült, és természetesen ugyanolyan hozzáféréssel rendelkeztek, mint mi, akkor azt gyanítjuk, hogy az USAID-hez és a biológiai hadviseléshez kapcsolódó dezinformációs erőfeszítés részei.

A gyanú nem bizonyíték. A bizonyíték a bizonyíték, és elég bizonyíték van ahhoz, hogy belefulladjunk. Köszönet az amerikai egészségügyi szakembereknek, akik az amerikai hadseregnek és a CIA-nak adták ki magukat, és akik segítettek eljutni oda, ahol most vagyunk, egy darabokra tört nemzethez…VeteransToday ]

Pravda.Ru: Ilyen anyag jelent meg 2015-ben a Natura című tudományos folyóirat honlapján 2015-ben. Akkor a szerzők azt állították, hogy a SARS-vírus (2002-2003) és a közel-keleti légzőszervi szindróma (MERS) megjelenése után a tudósok tisztában voltak a fajok közötti átvitel kockázatával, amely járványhoz vezethet az emberek között.

Sikeres laboratóriumi kísérlet

A kutatócsoport többek között a denevéreket tanulmányozta, amelyek a koronavírusok legnagyobb inkubátorai. Ennek ellenére a denevérek nem tudták átadni a koronavírust az emberre, mert nem tudtak kölcsönhatásba lépni az ACE2 receptorokkal rendelkező emberi sejtekkel.

Az anyag azt is megállapította, hogy a patkósdenevérek a SARS koronavírus egy olyan törzsét hordozzák, amely átvihető az emberre. Ezt a vírust SHC014-CoV vírusnak nevezték el.

E vírus jobb tanulmányozása érdekében a tudósok lemásolták a koronavírust, és laboratóriumi egereket fertőztek meg vele. Az eredmények azt mutatták, hogy a vírus valóban képes az ACE2 receptorokkal rendelkező emberi sejtekhez kötődni és a légzőrendszer sejtjeiben szaporodni.

A kutatómunkában megjegyzik, hogy a kutatáshoz használt laboratóriumi anyagokat, mintákat és berendezéseket a Hadsereg Orvosi Kutatóintézetének Fertőző Betegségek Intézetében szerezték be. Bár még nem lehet biztosan kijelenteni, hogy a laboratóriumi egereken tesztelt vírus megegyezik a SARS-Cove-2 koronavírussal.

A korábbi dokumentumokban azonban érdekes dolgokat találhatunk.

Például:

• A szövetség 2019-es tevékenységi jelentése szerint 2019-ben a kutatás-fejlesztés terén a szövetség első helyét a radiokémiai és biológiai védelem témája foglalta el (29%), elmozdítva Európa legégetőbbnek tűnő problémáját, a terrorizmus elleni küzdelmet (kiderült, hogy ez 4- m prioritás).
  Egy évvel korábban, 2018-ban a helyzet éppen fordított volt: a terrorizmus, ahogy kell, az első helyen állt (28%), a radiokémiai és biológiai védelem pedig a negyedik helyen (13%).
  Ahogy a brüsszeli besúgó írja a távirati csatornán, „mivel a tudományos érdekek ilyen éles változásának látható okai nincsenek, két lehetőség van, és mindkettő kellemetlen:
• Vagy a NATO most az ötödik pontot csóválja, meghamisítva az adatokat, hogy megmutassa: „és mi mindig felkészültünk a vírusokra, modernek vagyunk”,
  vagy még 2019-ben a szövetségben, Isten bocsássa meg, tudták, honnan jön a baj.
  Igen, az első lehetőség sokkal reálisabb, de látod, a tények meglepőek.

Forrás: B: Pravda

 

Eredeti 2015-ös kutatás szerkesztetlen és teljes

Közzétéve: 2015. november 09. A keringő denevérkoronavírusok SARS-szerű klasztere potenciális lehetőséget mutat az emberi megjelenésre Vineet D Menachery, Boyd L Yount Jr, Kari Debbink, Sudhakar Agnihothram, Lisa E Gralinski, Jessica A Plante, Rachel L Graham, Trevor Scobey, Xing-Yi Ge, Eric F Donaldson, Scott H Randell, Antonio Lanzavecchia, Wayne A Marasco, Zhengli-Li Shi, Ralph S Baric.

Nature Medicine 21. kötet, 1508-1513. oldal (2015)

A cikk helyesbítése 2016. április 06-án jelent meg.

A súlyos akut légzőszervi szindrómás koronavírus (SARS-CoV) és a közel-keleti légzőszervi szindróma (MERS)-CoV megjelenése aláhúzza az emberben kitörésekhez vezető, fajok közötti átviteli események veszélyét. Ebben a tanulmányban egy SARS-szerű vírus, az SHC014-CoV megbetegedési potenciálját vizsgáljuk, amely jelenleg a kínai patkósdenevér-populációkban kering1. A SARS-CoV reverz genetikai rendszer2 segítségével olyan kiméra vírust hoztunk létre és jellemeztünk, amely a denevérkoronavírus SHC014 tüskéjét egy egérre adaptált SARS-CoV gerincben fejezi ki.

Az eredmények azt mutatják, hogy az SHC014 tüskét vad típusú gerincben kódoló 2b csoportú vírusok képesek hatékonyan használni a SARS-receptor humán angiotenzin-konvertáló enzim II (ACE2) több ortológját, hatékonyan szaporodnak primer humán légúti sejtekben, és a SARS-CoV járványos törzseivel egyenértékű in vitro titereket érnek el. Emellett in vivo kísérletek bizonyítják a kiméra vírus szaporodását egér-tüdőben, figyelemre méltó patogenezissel.

A rendelkezésre álló SARS-alapú immunterápiás és profilaktikus módszerek értékelése gyenge hatékonyságot mutatott; mind a monoklonális antitest, mind a vakcina megközelítés nem tudta semlegesíteni és megvédeni a CoV-fertőzést az új tüskés fehérje használatával.

Ezen eredmények alapján szintetikusan újra előállítottunk egy fertőző teljes hosszúságú SHC014 rekombináns vírust, és mind in vitro, mind in vivo robusztus vírusreplikációt mutattunk ki. Munkánk a jelenleg denevérpopulációkban keringő vírusokból származó SARS-CoV újbóli megjelenésének potenciális kockázatára utal.

A SARS-CoV megjelenése új korszakot jelentett a súlyos légzőszervi megbetegedések fajok közötti átvitelében, a globalizáció pedig gyors terjedéshez vezetett világszerte, és hatalmas gazdasági hatást gyakorolt3,4. Azóta számos törzs – köztük az influenza A H5N1, H1N1 és H7N9 törzsek, valamint a MERS-CoV – jelent meg állatpopulációkból, jelentős megbetegedéseket, halálozást és gazdasági nehézségeket okozva az érintett régiókban5. Bár a közegészségügyi intézkedésekkel sikerült megállítani a SARS-CoV járvány kitörését4 , a közelmúltban végzett metagenomikai vizsgálatok a kínai denevérpopulációkban keringő, közeli rokonságban álló SARS-szerű vírusok szekvenciáit azonosították, amelyek a jövőben veszélyt jelenthetnek1,6.

A szekvenciaadatok önmagukban azonban minimális betekintést nyújtanak a jövőbeli járvány előtti vírusok azonosításához és az azokra való felkészüléshez. Ezért a cirkuláló denevér-CoV-ok emergenciapotenciáljának (azaz az emberek megfertőzésének) vizsgálata érdekében egy új, zoonotikus CoV tüskefehérjét kódoló kiméra vírust építettünk – a kínai patkósdenevérekből izolált RsSHC014-CoV szekvenciából1 – a SARS-CoV egérre adaptált gerincének kontextusában. A hibrid vírus lehetővé tette számunkra, hogy értékeljük az új spike fehérje betegséget okozó képességét, függetlenül a természetes gerinchálózatában található egyéb szükséges adaptív mutációktól.

Ezzel a megközelítéssel jellemeztük az SHC014 spike fehérje által közvetített CoV-fertőzést primer emberi légúti sejtekben és in vivo, valamint teszteltük a rendelkezésre álló immunterápiák hatékonyságát az SHC014-CoV ellen. A stratégia együttesen fordítja le a metagenomikai adatokat, hogy segítsen a jövőben megjelenő vírusok előrejelzésében és felkészülésében.

Az SHC014 és a rokon RsWIV1-CoV szekvenciái azt mutatják, hogy ezek a CoV-ok a legközelebbi rokonai a járványos SARS-CoV törzseknek (1a,b ábra); azonban fontos különbségek vannak abban a 14 maradékban, amelyek a humán ACE2-t, a SARS-CoV receptorát kötik, beleértve azt az ötöt, amely kritikus a gazdaszervezet hatótávolságához: Y442, L472, N479, T487 és Y491 (hivatkozás 7).

A WIV1-ben e maradékok közül három eltér a járványos SARS-CoV Urbani törzstől, de ezek várhatóan nem változtatják meg az ACE2-hez való kötődést (1a,b kiegészítő ábra és 1. kiegészítő táblázat). Ezt a tényt megerősítik mind az áltipizálási kísérletek, amelyekben megmérték a WIV1 tüskés fehérjéket kódoló lentivírusok azon képességét, hogy humán ACE2-t expresszáló sejtekbe lépjenek be (1. kiegészítő ábra), mind pedig a WIV1-CoV in vitro replikációs vizsgálatai (1. hivatkozás). Ezzel szemben az SHC014 14 ACE2-interakciós maradékából 7 különbözik a SARS-CoV-ban lévőktől, beleértve mind az öt, a gazdaszervezet hatótávolsága szempontjából kritikus maradékot (1c. kiegészítő ábra és 1. kiegészítő táblázat).

Ezek a változások, valamint az SHC014 tüskét expresszáló pszeudotipizált lentivírusok sejtbe jutási kudarca (1d. kiegészítő ábra) arra engedett következtetni, hogy az SHC014 tüske nem képes a humán ACE2-t megkötni. Ugyanakkor a rokon SARS-CoV-törzsek hasonló változásairól már beszámoltak, amelyek lehetővé teszik az ACE2 megkötését7,8 , ami arra utal, hogy további funkcionális vizsgálatokra van szükség az ellenőrzéshez.

Ezért szintetizáltuk az SHC014 tüskét a replikáció-kompetens, egérre adaptált SARS-CoV gerincvelővel összefüggésben (a továbbiakban a kiméra CoV-ra SHC014-MA15-ként hivatkozunk), hogy maximalizáljuk a lehetőséget az egerekben végzett patogenezis- és vakcinavizsgálatokra (2a. kiegészítő ábra). A szerkezetalapú modellezésből és az áltipizálási kísérletekből származó előrejelzések ellenére az SHC014-MA15 életképes volt és magas titerig replikálódott Vero sejtekben (2b. kiegészítő ábra). A SARS-hoz hasonlóan az SHC014-MA15-nek is szüksége volt egy funkcionális ACE2 molekulára a bejutáshoz, és képes volt használni az emberi, a cibet és a denevér ACE2 ortológjait (2c,d kiegészítő ábra).

Annak tesztelésére, hogy az SHC014 tüske képes-e közvetíteni a humán légutak fertőzését, megvizsgáltuk a Calu-3 2B4 humán epithelialis légúti sejtvonal (hivatkozás 9) fertőzéssel szembeni érzékenységét, és a SARS-CoV Urbaniéhoz hasonlóan robusztus SHC014-MA15 replikációt találtunk (1c. ábra).

Ezen eredmények kiterjesztése érdekében primer humán légúti epitél (HAE) kultúrákat fertőztek meg, és mindkét vírus robusztus replikációját mutatták ki (1d. ábra). Az adatok együttesen megerősítik az SHC014 tüskével rendelkező vírusok képességét az emberi légúti sejtek megfertőzésére, és aláhúzzák az SHC014-CoV fajok közötti átvitelének potenciális veszélyét.

1. ábra: A SARS-szerű vírusok emberi légúti sejtekben szaporodnak és in vivo patogenezist idéznek elő.

(a) A reprezentatív CoV-k teljes hosszúságú genomszekvenciáit összehangoltuk és filogenetikusan feltérképeztük az Online módszerek című fejezetben leírtak szerint. A skálasáv a nukleotidcseréket jelöli, és csak a 70% feletti bootstrap-támogatás van jelölve. A fa a CoV-ket három különböző filogenetikai csoportra osztva mutatja, amelyeket α-CoV-ként, β-CoV-ként és γ-CoV-ként definiáltunk. A klasszikus alcsoportok klasztereit a β-CoV-ok esetében 2a, 2b, 2c és 2d, az α-CoV-ok esetében pedig 1a és 1b jelöli. (b) A 2b csoportba tartozó reprezentatív β-CoV-ok, köztük a SARS-CoV tüskéinek S1-doménjeinek aminosav-szekvenciáit összehangoltuk és filogenetikusan feltérképeztük. A skálasáv az aminosavcseréket jelöli. (c,d) A SARS-CoV Urbani (fekete) és az SHC014-MA15 (zöld) vírusreplikációja Calu-3 2B4 sejtek (c) vagy jól differenciált, primer levegő-folyadék határfelületű HAE sejtkultúrák (d) fertőzése után, mindkét sejttípus esetében 0,01-es fertőzési multiplicitás (MOI) mellett. A mintákat egyedi időpontokban gyűjtöttük biológiai ismétlésekkel (n = 3) mind a Calu-3, mind a HAE kísérletek esetében. (e,f) SARS-CoV MA15 esetén n = 9; SHC014-MA15 esetén n = 16) (e) és vírusreplikáció a tüdőben (n = 3 SARS-CoV MA15 esetén; n = 4 SHC014-MA15 esetén) (f) 10 hetes BALB/c egerek súlyvesztése (n = 9; SHC014-MA15 esetén n = 16) (e), amelyeket 1 × 104 p. f.u. egér-adaptált SARS-CoV MA15 (fekete) vagy SHC014-MA15 (zöld) intranazális (i.n.) úton történő fertőzésével. (g,h) SARS-CoV MA15-tel (n = 3 egér) (g) vagy SHC014-MA15-tel (n = 4 egér) (h) fertőzött egerek SARS-CoV N antigénnel festett tüdőmetszeteinek reprezentatív képei láthatók. Minden ábrán a középső érték a csoport átlagát jelenti, a hibasávok pedig a s.e.m.-t. A méretarányos sávok 1 mm.

Az SHC014 tüske in vivo fertőzésközvetítő szerepének értékeléséhez 10 hetes BALB/c egereket fertőztünk meg 104 plakkképző egységnyi (p.f.u.) SARS-MA15 vagy SHC014-MA15 vírussal (1e-h ábra). A SARS-MA15-tel fertőzött állatoknál a fertőzést követő 4 d-re (d.p.i.) gyors súlyvesztés és letalitás következett be; ezzel szemben az SHC014-MA15 fertőzés jelentős súlyvesztést (10%), de nem okozott letalitást az egerekben (1e. ábra). A vírusreplikáció vizsgálata közel azonos vírustitereket mutatott ki a SARS-MA15-tel vagy SHC014-MA15-tel fertőzött egerek tüdejéből (1f. ábra). Míg a SARS-MA15-tel fertőzött egerek tüdeje erőteljes festődést mutatott mind a terminális bronchiolákban, mind a tüdőparenchimában 2 d.p.i. (1g. ábra), az SHC014-MA15-tel fertőzött egerek tüdeje csökkent légúti antigénfestődést mutatott (1g. ábra). 1h); ezzel szemben a parenchimában vagy a teljes szövettani értékelésben nem volt megfigyelhető az antigénfestődés hiánya, ami a tüdőszövetek SHC014-MA15 általi differenciált fertőzésére utal (2. kiegészítő táblázat).

Ezután elemeztük a fertőzést fogékonyabb, idős (12 hónapos) állatokban. A SARS-MA15-tel fertőzött állatok gyorsan fogytak és elpusztultak a fertőzés következtében (3a,b. kiegészítő ábra). Az SHC014-MA15 fertőzés erőteljes és tartós súlycsökkenést okozott, de minimális letalitással járt. A fiatal egereknél megfigyelt szövettani és antigénfestési mintázatok tendenciái az idősebb állatoknál is megmaradtak (3. kiegészítő táblázat). Az Ace2-/- egerekkel végzett kísérletek alapján kizártuk annak lehetőségét, hogy az SHC014-MA15 egy alternatív receptoron keresztül közvetíti a fertőzést, mivel az SHC014-MA15 fertőzést követően nem mutattak súlycsökkenést vagy antigénfestődést (4a,b. kiegészítő ábra és 2. kiegészítő táblázat). Az adatok együttesen azt jelzik, hogy az SHC014 tüskével rendelkező vírusok virulens CoV gerincvelővel összefüggésben képesek egerekben testsúlycsökkenést előidézni.

Tekintettel az Ebola monoklonális antitest terápiák, mint például a ZMApp10 preklinikai hatékonyságára, ezután a SARS-CoV monoklonális antitestek hatékonyságát próbáltuk meghatározni az SHC014-MA15 fertőzéssel szemben. Korábban már négy, a SARS-CoV spike fehérjéjét célzó, széles körben semlegesítő humán monoklonális antitestről számoltak be, amelyek valószínűsíthetően az immunterápia reagenseit jelentik11,12,13. Megvizsgáltuk ezeknek az antitesteknek a vírusreplikációra gyakorolt hatását (a vírusreplikáció százalékos gátlásában kifejezve), és azt találtuk, hogy míg a vad típusú SARS-CoV Urbani-t mind a négy antitest erősen semlegesítette viszonylag alacsony antitest-koncentrációban (2a-d ábra), az SHC014-MA15 esetében a semlegesítés változó volt. Az Fm6, egy fágmegjelenítéssel és escape mutánsokkal11,12 létrehozott antitest csak háttérszintű gátlást ért el az SHC014-MA15 replikációjában (2a. ábra). Hasonlóképpen, a 230.15 és 227.14 antitestek, amelyek SARS-CoV-fertőzött betegek13 memória B-sejtjeiből származnak, szintén nem blokkolták az SHC014-MA15 replikációját (2b,c ábra). Mindhárom antitest esetében a SARS és az SHC014 tüske aminosav szekvenciái közötti különbségek megfeleltek a SARS-CoV menekülő mutánsokban talált közvetlen vagy szomszédos maradékok változásainak (fm6 N479R; 230.15 L443V; 227.14 K390Q/E), ami valószínűleg megmagyarázza az antitestek SHC014 elleni semlegesítő aktivitásának hiányát. Végül a 109.8 monoklonális antitest képes volt 50%-os semlegesítést elérni az SHC014-MA15 ellen, de csak magas koncentrációban (10 μg/ml) (2d. ábra). Az eredmények együttesen azt mutatják, hogy a SARS-CoV elleni széleskörűen semlegesítő antitestek csak marginális hatékonysággal rendelkeznek az olyan újonnan megjelenő SARS-szerű CoV-törzsekkel szemben, mint az SHC014.

2. ábra: A SARS-CoV monoklonális antitestek marginális hatékonysággal rendelkeznek a SARS-szerű CoV-k ellen.

(a-d) A monoklonális antitestek egy csoportjának – amelyek mindegyike eredetileg járványos SARS-CoV ellen készült – hatékonyságát (a plakkok számának csökkenéseként mérve) értékelő neutralizációs vizsgálatok Vero sejtek SARS-CoV Urbani (fekete) vagy SHC014-MA15 (zöld) fertőzése ellen. A vizsgált antitestek a következők voltak: fm6 (n = 3 az Urbani esetében; n = 5 az SHC014-MA15 esetében)11,12 (a), 230,15 (n = 3 az Urbani esetében; n = 2 az SHC014-MA15 esetében) (b), 227,15 (n = 3 az Urbani esetében; n = 5 az SHC014-MA15 esetében) (c) és 109,8 (n = 3 az Urbani esetében; n = 2 az SHC014-MA15 esetében)13 (d). Minden adatpont a csoportátlagot jelenti, a hibasávok pedig az s.e.m.-t. Megjegyzendő, hogy a b,c-ben szereplő SARS-CoV Urbani-fertőzött Vero-sejtek hibasávjai átfedésben vannak a szimbólumokkal, és nem láthatóak.

A meglévő vakcinák SHC014-MA15 fertőzéssel szembeni hatékonyságának értékelésére idős egereket vakcináztunk kétszeresen inaktivált teljes SARS-CoV-val (DIV). Korábbi munkák kimutatták, hogy a DIV képes semlegesíteni és megvédeni a fiatal egereket a homológ vírussal való megfertőzéssel szemben14; a vakcina azonban nem védte meg az idős állatokat, amelyeknél fokozott immunpatológiát is megfigyeltek, ami arra utal, hogy a vakcinázás miatt az állatok károsodhatnak15. Itt azt találtuk, hogy a DIV nem nyújtott védelmet az SHC014-MA15 elleni kihívással szemben a testsúlycsökkenés vagy a vírustiter tekintetében (5a,b. kiegészítő ábra). Összhangban egy korábbi, más heterológ csoportok 2b CoV-ival15 készített jelentéssel, a DIV-vel oltott, idős egerekből származó szérum szintén nem semlegesítette az SHC014-MA15-öt (5c. kiegészítő ábra).

Figyelemre méltó, hogy a DIV-vakcináció robusztus immunpatológiát (4. kiegészítő táblázat) és eozinofíliát eredményezett (5d-f. kiegészítő ábra). Ezek az eredmények együttesen megerősítik, hogy a DIV vakcina nem nyújt védelmet az SHC014 fertőzéssel szemben, és esetleg fokozhatja a betegséget az idős vakcinázott csoportban.

Az egerek DIV-vel történő vakcinázásával ellentétben az SHC014-MA15 élő, attenuált vakcinaként történő alkalmazása potenciális keresztvédelmet mutatott a SARS-CoV-vel való kihívással szemben, de az eredményeknek fontos fenntartásai vannak. Fiatal egereket fertőztünk 104 p.f.u. SHC014-MA15-tel, és 28 d-ig megfigyeltük őket. Ezt követően a 29. napon SARS-MA15-tel kihívtuk az egereket (6a. kiegészítő ábra). Az egerek előzetes fertőzése a nagy dózisú SHC014-MA15-tel védelmet nyújtott a SARS-MA15 halálos dózisával való kihívással szemben, bár az SHC014-MA15 fertőzés után 28 nappal kiváltott antiszérákból csak minimális SARS-CoV-neutralizációs választ kaptunk (6b. kiegészítő ábra, 1:200). Másodlagos antigénlökés hiányában a 28 d.p.i. jelenti az antitesttiterek várható csúcspontját, és azt jelenti, hogy idővel csökken a SARS-CoV elleni védelem16,17. Hasonló eredményeket mutattak ki a SARS-CoV halálos dózisával szembeni védelmet idős BALB/c egereknél a testsúlycsökkenés és a vírusszaporodás tekintetében (6c,d. kiegészítő ábra). A 104 p.f.u. SHC014-MA15 fertőzési dózis azonban néhány idős állatban >10%-os súlycsökkenést és letalitást idézett elő (1. ábra és 3. kiegészítő ábra). Megállapítottuk, hogy az SHC014-MA15 alacsonyabb dózisú (100 p.f.u.) vakcinázása nem okozott súlyvesztést, de nem védte meg az idős állatokat a SARS-MA15 halálos dózisú kihívással szemben (6e,f kiegészítő ábra). Az adatok együttesen arra utalnak, hogy az SHC014-MA15 kihívás konzervált epitópokon keresztül keresztvédelmet nyújthat a SARS-CoV ellen, de a szükséges dózis patogenezist indukál, és kizárja a gyengített vakcinaként való felhasználást.

Miután megállapítottuk, hogy az SHC014 tüske képes emberi sejtek fertőzését közvetíteni és egerekben megbetegedést okozni, ezután szintetizáltunk egy teljes hosszúságú SHC014-CoV fertőző klónt a SARS-CoV esetében alkalmazott megközelítés alapján (3a. ábra)2 . A Vero sejtekben történő reprodukció nem mutatott hiányt az SHC014-CoV esetében a SARS-CoV-hoz képest (3b. ábra); azonban az SHC014-CoV szignifikánsan (P < 0,01) gyengült primer HAE-kultúrákban a fertőzést követő 24 és 48 órában (3c. ábra). Az egerek in vivo fertőzése nem mutatott jelentős súlycsökkenést, de a teljes hosszúságú SHC014-CoV fertőzéssel fertőzött tüdőben csökkent vírusreplikációt mutatott a SARS-CoV Urbani-hoz képest (3d. ábra, e). Az eredmények együttesen igazolják a teljes hosszúságú SHC014-CoV életképességét, de azt sugallják, hogy további adaptációra van szükség ahhoz, hogy a replikációja egyenértékű legyen a járványos SARS-CoV-éval emberi légzőszervi sejtekben és egerekben.

3. ábra: A teljes hosszúságú SHC014-CoV szaporodik emberi légutakban, de nem rendelkezik a járványos SARS-CoV virulenciájával.

(a) Az SHC014-CoV molekuláris klón vázlata, amelyet hat összefüggő cDNS-ként szintetizáltak (SHC014A, SHC014B, SHC014C, SHC014D, SHC0144E és SHC014F), amelyeket egyedi BglI-helyek szegélyeznek, amelyek lehetővé tették a teljes hosszúságú cDNS nyílt olvasókereteket (az 1a, 1b, spike, 3, burok, mátrix, 6-8 és nukleokapszid) kifejező cDNS irányított összeállítását. Az aláhúzott nukleotidok a restrikciós enzim hasítása után kialakult overhang szekvenciákat jelölik. (b,c) A SARS-CoV Urbani (fekete) vagy az SHC014-CoV (zöld) vírusreplikációja Vero sejtek (b) vagy jól differenciált, primer levegő-folyadék határfelületű HAE sejttenyészetek (c) 0,01-es MOI mellett történő fertőzése után. A mintákat egyedi időpontokban gyűjtöttük, minden csoport esetében biológiai ismétlésekkel (n = 3). Az adatok egy kísérletet képviselnek mind a Vero, mind a HAE sejtek esetében. (d,e) SARS-CoV MA15 esetében n = 3, SHC014-CoV esetében n = 7; SARS-Urbani esetében n = 6) (d) 10 hetes BALB/c egerek súlyvesztése (n = 3 SARS-CoV MA15, n = 7 SHC014-CoV; n = 6 SARS-Urbani) (d) és vírusreplikáció a tüdőben (n = 3 SARS-Urbani és SHC014-CoV) (e) 10 hetes BALB/c egereknél, amelyeket 1 × 105 p. fertőzött. f.u. SARS-CoV MA15 (szürke), SHC014-CoV (zöld) vagy SARS-CoV Urbani (fekete) vírussal i.n. úton. Minden adatpont a csoportátlagot jelenti, a hibasávok pedig az s.e.m. értéket határozzák meg. **P < 0,01 és ***P < 0,001 az egyes időpontok kétfarkú Student’s t-próbája alapján.

A SARS-CoV-járvány idején gyorsan kapcsolatot találtak a pálmacibet és az emberekben kimutatott CoV-törzsek között4.

Erre a megállapításra építve a közös megjelenési paradigma szerint a járványos SARS-CoV denevérvírusként indult, átugrott a cibetvírusokra, és a receptor-kötő domén (RBD) módosításait beépítette a cibetvírus Ace2-hez való jobb kötődés érdekében (hivatkozás 18).

Az élőállat-piacokon az emberekkel való későbbi érintkezés lehetővé tette az emberi fertőzést a cibet törzzsel, amely viszont a járványos törzzé vált (4a. ábra).

A filogenetikai elemzés azonban arra utal, hogy a korai emberi SARS-törzsek közelebbi rokonságban állnak a denevértörzsekkel, mint a cibet törzsekkel18.

Ezért egy másik paradigma szerint a SARS-CoV megjelenését a denevér-ember közötti közvetlen átvitel indította el, a pálmacibet pedig másodlagos gazdaként és rezervoárként szolgált a fertőzés folytatásához (4b. ábra)19 . Mindkét paradigma esetében a másodlagos gazdaszervezetben a tüskék adaptációja szükségszerűnek tekinthető, és a legtöbb mutáció várhatóan az RBD-n belül történik, ami megkönnyíti a jobb fertőzést. Mindkét elmélet azt feltételezi, hogy a denevér CoV-ok pooljai korlátozottak, és hogy a gazdaszervezetre terjedő mutációk véletlenszerűek és ritkák, ami csökkenti az emberben történő jövőbeli megjelenés valószínűségét.

4. ábra: A koronavírusok megjelenési paradigmái.

 

A koronavírustörzseket a denevérpopulációkban keringő kvázi-fajok tartják fenn. (a,b) A hagyományos SARS-CoV megjelenési elméletek szerint a gazdanövénytartományban előforduló mutánsok (piros kör) véletlenszerű és ritka előfordulásokat jelentenek, amelyek lehetővé teszik alternatív gazdák fertőzését. A másodlagos gazdaszervezet paradigma (a) szerint egy nem emberi gazdaszervezetet megfertőz egy denevérprogenitor vírus, és az adaptáció révén megkönnyíti az emberre történő átvitelt; az ezt követő szaporodás az emberben a járványos vírustörzs kialakulásához vezet. A közvetlen paradigma (b) szerint az átvitel a denevérek és az emberek között köztes gazda nélkül történik; ezután az emberi populációban szelekció történik a közeli rokon vírusokkal, amelyek egy másodlagos gazdában szaporodnak, lehetővé téve a vírus folyamatos fennmaradását és alkalmazkodását mindkettőben. (c) A kiméra SARS-szerű vírusok adatai amellett érvelnek, hogy a kvázi fajkészletek több olyan vírust tartanak fenn, amelyek mutációk nélkül képesek megfertőzni az emberi sejteket (piros körök). Bár a járványok kialakulásához szükség lehet a másodlagos vagy emberi gazdaszervezetekben történő adaptációra, ha az SHC014 tüskét tartalmazó vírusok virulens CoV gerinccel rekombinálódnak (zöld körvonallal jelölt körök), akkor az emberekben járványos megbetegedés lehet az eredmény. A meglévő adatok mindhárom paradigma elemeit alátámasztják.

Bár tanulmányunk nem érvényteleníti a többi megjelenési útvonalat, egy harmadik paradigma mellett érvel, amelyben a cirkuláló denevér CoV-állományok „készenlétben” tartják a tüskés fehérjéket, amelyek mutáció vagy adaptáció nélkül képesek megfertőzni az embert (4c. ábra). Ezt a hipotézist illusztrálja az SHC014 tüskét SARS-CoV gerincben tartalmazó kiméra vírus azon képessége, hogy RBD-adaptáció nélkül is képes robusztus fertőzést okozni emberi légúti kultúrákban és egerekben.

A korábban azonosított patogén CoV-hátterek3,20 megfigyelésével együtt eredményeink arra utalnak, hogy a SARS-szerű újonnan megjelenő törzsekhez szükséges kiindulási anyagok jelenleg az állati rezervoárokban keringenek. Bár a teljes hosszúságú SHC014-CoV valószínűleg további gerincadaptációt igényel ahhoz, hogy emberi betegséget közvetítsen, a CoV-családokban dokumentált nagy gyakoriságú rekombinációs események aláhúzzák a jövőbeli megjelenés lehetőségét és a további felkészülés szükségességét.

Eddig az állatpopulációk genomikai szűrését elsősorban új vírusok azonosítására használták járványkitörésekben21. Az itt alkalmazott megközelítés kiterjeszti ezeket az adatkészleteket a vírusok megjelenésének és terápiás hatékonyságának kérdéseinek vizsgálatára. Az SHC014 tüskével rendelkező vírusokat potenciális fenyegetésnek tekintjük, mivel képesek szaporodni az elsődleges emberi légúti kultúrákban, az emberi betegség legjobb rendelkezésre álló modelljében. Ezenkívül az egerekben megfigyelt patogenezis azt jelzi, hogy az SHC014-tartalmú vírusok képesek betegséget okozni emlős modellekben, RBD adaptáció nélkül.

Különösen a tüdőben a SARS-MA15-höz képest eltérő tropizmus és a teljes hosszúságú SHC014-CoV gyengülése HAE-kultúrákban a SARS-CoV Urbanihez képest arra utal, hogy az ACE2-kötődésen kívüli tényezők – beleértve a tüskék processzivitását, a receptor biológiai hozzáférhetőségét vagy a gazdaszervezet immunválaszainak antagonizmusát – hozzájárulhatnak a kialakuláshoz. Azonban további vizsgálatokra van szükség főemlősökön ahhoz, hogy ezeket az eredményeket az emberekre vonatkozó patogén potenciálra fordíthassuk.

Fontos, hogy a rendelkezésre álló terápiák sikertelensége kritikus szükségletet határoz meg a további vizsgálatok és a kezelések kifejlesztése szempontjából. Ezen ismeretek birtokában olyan felügyeleti programok, diagnosztikai reagensek és hatékony kezelések állíthatók elő, amelyek védelmet nyújtanak a 2b csoport-specifikus CoV-k, például az SHC014 megjelenésével szemben, és ezeket más, hasonlóan heterogén állományt fenntartó CoV-ágakra is alkalmazni lehet.

Amellett, hogy felkészülést kínál a jövőben megjelenő vírusok ellen, ezt a megközelítést az amerikai kormány által előírt, a funkciógyarapodási vizsgálatokra vonatkozó szüneteltetéssel22 összefüggésben is figyelembe kell venni.

A korábbi megjelenési modellek alapján (4a. ábra, b. ábra) az SHC014-MA15-hez hasonló kiméra vírusok létrehozásától nem várták a patogenitás növekedését. Bár az SHC014-MA15 attenuált a szülői, egérre adaptált SARS-CoV-hoz képest, hasonló vizsgálatok, amelyek a vad típusú Urbani tüskét tartalmazó CoV-ok patogenitását vizsgálták az MA15 gerincen belül, nem mutattak súlycsökkenést egerekben és csökkent vírusreplikációt23. Így az Urbani spike-MA15 CoV-hoz képest az SHC014-MA15 ismét patogenezist mutat (1. ábra).

Ezen eredmények alapján a tudományos felülvizsgálati testületek a hasonló, keringő törzseken alapuló kiméra vírusokat építő vizsgálatokat túl kockázatosnak ítélhetik, mivel nem zárható ki a fokozott patogenitás emlős modellekben.

Az egérre adaptált törzsekre vonatkozó korlátozásokkal és a menekülő mutánsokat használó monoklonális antitestek fejlesztésével együtt a CoV-k megjelenésének és terápiás hatékonyságának kutatása a jövőben erősen korlátozott lehet. Ezek az adatok és korlátozások együttesen a GOF-kutatással kapcsolatos aggályok kereszteződését jelentik; a jövőbeli járványokra való felkészülés és azok enyhítésének lehetőségét mérlegelni kell a még veszélyesebb kórokozók létrehozásának kockázatával szemben. A jövőre vonatkozó politikák kidolgozásakor fontos mérlegelni az e vizsgálatok által generált adatok értékét, és azt, hogy az ilyen típusú kiméra vírus vizsgálatok indokolják-e a további vizsgálatokat a velük járó kockázatokkal szemben.

Összességében megközelítésünk a metagenomikai adatok felhasználásával azonosította a cirkuláló denevér SARS-szerű CoV SHC014 által jelentett potenciális veszélyt. Mivel a kimérikus SHC014 vírusok képesek emberi légúti kultúrákban szaporodni, in vivo patogenezist okozni és a jelenlegi terápiás szerek elől menekülni, mind a felügyeletre, mind a keringő SARS-szerű vírusok elleni jobb terápiára szükség van. Megközelítésünk a metagenomikai adatok felhasználását is lehetővé teszi a vírusok megjelenésének előrejelzésére, valamint ezen ismeretek alkalmazására a jövőben megjelenő vírusfertőzések kezelésére való felkészülésben.

 

Módszerek

Vírusok, sejtek, in vitro fertőzés és plakkvizsgálatok
A vad típusú SARS-CoV-ot (Urbani), az egérhez adaptált SARS-CoV-ot (MA15) és a kiméra SARS-szerű CoV-okat Vero E6 sejteken tenyésztettük (az Egyesült Államok Hadsereg Orvosi Kutatóintézetének Fertőző Betegségek Intézetétől kaptuk), Dulbecco’s modified Eagle’s mediumban (DMEM) (Gibco, CA) és 5% magzati klónszérumban (FCS) (Hyclone, South Logan, UT), valamint antibiotikummal/antimikotikummal (Gibco, Carlsbad, CA) tenyésztettük. Az ACE2 ortológját expresszáló DBT sejteket (Baric laboratórium, forrás ismeretlen) korábban már leírták mind az ember, mind a cibet esetében; a denevér Ace2 szekvenciája a Rhinolophus leschenaultiból származó szekvencián alapult, és a denevér Ace2-t expresszáló DBT sejteket a korábban leírt módon hoztuk létre8.

Az áltipizálási kísérletek hasonlóak voltak a korábban leírtak szerint10 előállított HIV-alapú álvírus felhasználásával végzett kísérletekhez, amelyeket az ACE2 ortológot expresszáló HeLa sejteken (Wuhan Institute of Virology) vizsgáltunk. A HeLa sejteket a korábban leírtak szerint 10% FCS-vel (Gibco, CA) kiegészített minimál esszenciális tápfolyadékban (MEM) (Gibco, CA) tenyésztettük24.

A Vero E6, DBT, Calu-3 2B4 és primer humán légúti epitélsejtekben a korábban leírtak szerint végeztük el a növekedési görbéket8,25 . A munka sejtvonal állományok egyikét sem hitelesítették vagy vizsgálták a közelmúltban mikoplazma szempontjából, bár a munka állományok létrehozásához használt eredeti magállományok mentesek a szennyeződéstől. A HAE-kultúrákhoz használt emberi tüdőt az Észak-Karolinai Egyetem Chapel Hill-i intézményi felülvizsgálati bizottsága által jóváhagyott protokollok szerint szereztük be. A HAE-kultúrák magasan differenciált emberi légúti epithelt képviselnek, amely ciliált és nem ciliált epithelsejteket, valamint goblet sejteket tartalmaz. A tenyészeteket felhasználás előtt több hétig levegő-folyadék határfelületen is növesztik, a korábban leírtak szerint26.

Röviden, a sejteket PBS-szel mostuk, majd beoltottuk a vírussal vagy PBS-ben 40 percig 37 °C-on mock-hígított vírussal. A beoltás után a sejteket háromszor mostuk, és friss tápfolyadékot adtunk hozzá, hogy a „0” időpontot jelezzük. Minden egyes leírt időpontban három vagy több biológiai ismétlést gyűjtöttünk be. A mintagyűjtések során nem alkalmaztunk vakítást, és a mintákat nem randomizáltuk. Minden vírustenyésztést egy 3. biológiai biztonsági szintű (BSL) laboratóriumban végeztünk, a biológiai biztonsági szekrényekben redundáns ventilátorokkal, ahogyan azt csoportunk korábban leírta2. A személyzet minden tagja motoros légtisztító légzőkészüléket (Breathe Easy, 3M) viselt Tyvek-öltözékkel, kötényt és bakancsot, és dupla kesztyűt viselt.

Szekvencia klaszterezés és strukturális modellezés.

A reprezentatív CoV-k tüskéinek teljes hosszúságú genomi szekvenciáit és az S1 domének aminosav szekvenciáit a Genbankból vagy a Pathosystems Resource Integration Centerből (PATRIC) töltöttük le, a ClustalX segítségével illesztettük össze, és filogenetikai összehasonlítást végeztünk maximum likelihood becsléssel 100 bootstrap segítségével, illetve a PhyML csomag segítségével. A fát a PhyML csomag segítségével, maximális valószínűséggel generáltuk. A skálasáv a nukleotidcseréket jelöli. Csak a 70% feletti bootstrap-támogatással rendelkező csomópontok vannak jelölve.

A fa azt mutatja, hogy a CoV-k három különböző filogenetikai csoportra oszlanak, amelyeket α-CoV-ként, β-CoV-ként és γ-CoV-ként definiáltak. A klasszikus alcsoportok klasztereit a β-CoV-ok esetében a 2a, 2b, 2c és 2d, az α-CoV-ok esetében pedig az 1a és 1b jelöli. A szerkezeti modelleket a Modeller (Max Planck Institute Bioinformatics Toolkit) segítségével generáltuk a SARS RBD SHC014 és Rs3367 homológiamodelljeihez az ACE2-vel alkotott komplexben a 2AJF kristályszerkezet (Protein Data Bank) alapján. A homológiamodelleket MacPyMol (1.3-as verzió) programban vizualizáltuk és manipuláltuk.

Mind a vad típusú, mind a kiméra vírusokat a SARS-CoV Urbani vagy a megfelelő egérhez adaptált (SARS-CoV MA15) fertőző klónból (ic) származtattuk a korábban leírtak szerint27.

Az SHC014 tüskeszekvenciáit tartalmazó plazmidokat restrikciós emésztéssel kivontuk, és az MA15 fertőző klón E és F plazmidjába ligáltuk. A klónt hat összefüggő cDNS-ként tervezték és vásárolták a Bio Basic-tól, a publikált szekvenciák felhasználásával, amelyeket egyedi II. osztályú restrikciós endonukleáz-helyek (BglI) szegélyeznek. Ezt követően a vad típusú, kiméra SARS-CoV és SHC014-CoV genomrészleteket tartalmazó plazmidokat felszaporítottuk, kivágtuk, ligáltuk és tisztítottuk.

Ezután in vitro transzkripciós reakciókat végeztünk a teljes hosszúságú genomi RNS szintéziséhez, amelyet a korábban leírtak szerint Vero E6 sejtekbe transzfektáltunk2. A transzfektált sejtekből származó tápfolyadékot leszedtük, és az a későbbi kísérletekhez magkészletként szolgált. A kiméra és a teljes hosszúságú vírusokat szekvenciaelemzéssel igazoltuk, mielőtt e vizsgálatokban felhasználtuk volna. A kimérikus mutáns és teljes hosszúságú SHC014-CoV szintetikus konstrukcióját az Észak-Karolinai Egyetem Intézményi Biológiai Biztonsági Bizottsága és a Kettős felhasználású, aggodalomra okot adó kutatások bizottsága hagyta jóvá.

Etikai nyilatkozat

Ezt a vizsgálatot az NIH laboratóriumi állatok gondozására és felhasználására vonatkozó, az Office of Laboratory Animal Welfare (OLAW) által kiadott ajánlásoknak megfelelően végeztük. A Chapel Hill-i Észak-Karolinai Egyetem (UNC, engedélyszám: A-3410-01) intézményi állatgondozási és -használati bizottsága (IACUC) jóváhagyta az e vizsgálatokban alkalmazott állatkísérleti protokollt (IACUC #13-033).

Egerek és in vivo fertőzés

Nőstény, 10 hetes és 12 hónapos BALB/cAnNHsD egereket a Harlan Laboratories-tól rendeltünk. Az egérfertőzéseket a korábban leírtak szerint végeztük20. Röviden, az állatokat egy BSL3 laboratóriumba vitték, és a fertőzés előtt 1 hétig hagyták őket akklimatizálódni. A fertőzéshez és az élő, hígított vírusvakcinációhoz az egereket ketamin és xilazin keverékével altatták, és intranazálisan fertőzték meg őket, amikor kihívták őket, 50 μl foszfát-pufferelt sóoldattal (PBS) vagy hígított vírussal, három vagy négy egérrel, időpontonként, fertőzési csoportonként és dózisonként, az ábra legendáiban leírtak szerint.

Az egyes egerek esetében a fertőzésre vonatkozó megjegyzések, beleértve a teljes adag belégzésének elmulasztását, az inokulum orrból történő buborékosodását vagy a szájon keresztül történő fertőzést, a kutató döntése alapján az egéradatok kizárásához vezethettek; a fertőzés után nem határoztak meg más, előre meghatározott kizárási vagy felvételi kritériumokat. Az állatkísérletekben nem alkalmaztak vakítást, és az állatokat nem randomizálták. A vakcinázáshoz a fiatal és idős egereket lábpárna-injekcióval vakcinázták 20 μl térfogatú, 0,2 μg kettős inaktivált SARS-CoV vakcinával, alumíniummal vagy PBS-sel; az egereket 22 nappal később ugyanezzel a kezelési móddal fokozták, majd 21 nappal később kihívták őket.

Minden csoport esetében, a protokoll szerint, az állatokat a kísérlet időtartama alatt naponta megfigyelték a betegség klinikai tünetei (púposodás, felborzolt szőrzet és csökkent aktivitás) szempontjából. A súlyvesztést az első 7 napban naponta ellenőrizték, majd a testtömeg-ellenőrzést addig folytatták, amíg az állatok vissza nem álltak a kezdeti kiindulási súlyukra, vagy 3 napig folyamatosan súlygyarapodást mutattak.

Minden olyan egeret, amely a kiindulási testsúlyának 20%-ánál nagyobb mértékben veszített, daráltak és naponta többször is megfigyeltek, amíg a 20%-os határérték alatt maradtak. Azokat az egereket, amelyek kezdeti testsúlyuk 30%-ánál nagyobb mértékben veszítettek, a protokoll szerint azonnal feláldozták. Minden olyan egeret, amelyről úgy ítélték meg, hogy haldoklik vagy valószínűleg nem fog felépülni, a kutató döntése alapján szintén humánusan feláldozták. Az eutanáziát izoflurán túladagolással végeztük, és a halál beálltát nyaki dislokációval igazoltuk. Minden egérvizsgálatot az Észak-Karolinai Egyetemen végeztek (Animal Welfare Assurance #A3410-01) az UNC intézményi állatgondozási és -használati bizottsága (IACUC) által jóváhagyott protokollok alapján.

Hisztológiai elemzés.

A bal tüdőt eltávolítottuk, és 1 hétig 10%-os pufferelt formalinban (Fisher), felfúvás nélkül tartottuk. A szöveteket paraffinba ágyazták, és az UNC Lineberger Comprehensive Cancer Center szövettani központja 5 mm-es metszeteket készített. Az antigénfestés mértékének meghatározásához a metszeteket a vírusantigénre festettük a kereskedelmi forgalomban kapható poliklonális SARS-CoV anti-nukleokapszid antitesttel (Imgenex), és vakon pontoztuk a légutak és a parenchima festődését a korábban leírtak szerint20. A képeket Olympus DP71 kamerával felszerelt Olympus BX41 mikroszkóppal készítettük.

Vírusneutralizációs vizsgálatok.

A plakkredukciós semlegesítési titerpróbákat korábban jellemzett SARS-CoV elleni antitestekkel végeztük, a korábban leírtak szerint11,

12,13

. Röviden, a neutralizáló antitesteket vagy szérumot sorozatban kétszeresére hígítottuk, és a különböző fertőző klónok, SARS-CoV törzsek 100 p.f.u.-jával inkubáltuk 1 órán keresztül 37 °C-on. A vírust és az antitesteket ezután 5 × 105 Vero E6 sejtet/lyuk tartalmazó 6 lyukú lemezbe adtuk, többszörös replikációval (n ≥ 2). Az 1 órás 37 °C-on történő inkubációt követően a sejteket 3 ml 0,8%-os agarózzal fedtük le a táptalajban. A lemezeket 2 napig 37 °C-on inkubáltuk, majd 3 órán át semleges vörössel festettük, és megszámoltuk a plakkokat. A plakkok csökkenésének százalékos arányát a következőképpen számoltuk ki: (1 – (antitesttel rendelkező plakkok száma/antitest nélküli plakkok száma)) × 100.

Statisztikai elemzés

Minden kísérletet két kísérleti csoport (vagy két vírus, vagy vakcinázott és nem vakcinázott kohorsz) szembeállításával végeztünk. Ezért a vírustiter és a szövettani pontszámok szignifikáns különbségeit az egyes időpontokban kétfarkú Student’s t-próbával határoztuk meg. Az adatok normális eloszlásúak voltak minden összehasonlított csoportban, és hasonló szórással rendelkeztek.

Biológiai biztonság és biológiai védelem

A bejelentett vizsgálatokat azután kezdtük el, hogy az Észak-Karolinai Egyetem Intézményi Biológiai Biztonság Bizottság jóváhagyta a kísérleti protokollt (Project Title: A denevér SARS-szerű CoV-k fertőző klónjainak előállítása; Laborbiztonsági terv azonosítója: 20145741; G-terv azonosítója: 12279).

Ezeket a vizsgálatokat az USA kormányának az influenza-, MERS- és SARS-vírusokat érintő, a funkciónyereséggel kapcsolatos kiválasztott kutatásokról szóló, tanácskozási eljárás keretében történő kutatási finanszírozás szüneteltetése előtt kezdték meg. Ezt a dokumentumot a finanszírozó ügynökség, az NIH felülvizsgálta. A vizsgálatok folytatását kérték, és ezt az NIH jóváhagyta.

A SARS-CoV szelektív kórokozó. E tanulmányok minden munkáját a SARS-CoV, MERs-CoV és más rokon CoV vírusokra jóváhagyott szabványos működési eljárások (SOP) és biztonsági feltételek szerint végezték. Intézményi CoV BSL3 létesítményeinket úgy alakítottuk ki, hogy megfeleljenek a Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL), az Egyesült Államok Egészségügyi és Humán Szolgálatának, a Közegészségügyi Szolgálatnak, a Centers for Disease Control (CDC) és az NIH által ajánlott biztonsági követelményeknek. A laboratóriumi biztonsági terveket benyújtották az UNC Környezeti Egészségügyi és Biztonsági Osztályának (EHS) és a CDC-nek, és a létesítményt jóváhagyták. A létesítménybe való belépéshez elektronikus kártyás belépésre van szükség.

Az EHS minden dolgozót kiképzett a motoros légtisztító légzőkészülék (PAPR) biztonságos használatára, és a BSL3 létesítményben megfelelő munkaszokások, valamint aktív egészségügyi felügyeleti tervek vannak érvényben. A CoV BSL3 létesítményeink redundáns ventilátorokat, vészhelyzeti áramellátást tartalmaznak a ventilátorokhoz és a biológiai biztonsági szekrényekhez és fagyasztókhoz, és létesítményeinkben SealSafe egérállványok is elhelyezhetők. A BSL3 kórokozóként besorolt anyagok közé tartoznak a SARS-CoV, a denevér CoV prekurzor törzsek, a MERS-CoV és az ezekből a kórokozókból származó mutánsok. A BSL3 létesítményekben a fertőző vírussal végzett kísérleteket II. osztályú, tanúsított biológiai biztonsági szekrényben (BSC) végzik.

A személyzet minden tagja műtősruhát, Tyvek-öltözetet és kötényt, PAPR-t és cipőtakarót visel, és kezeiket dupla kesztyűvel védik. A BSL3-felhasználókra az Egyetemi Alkalmazottak Foglalkozás-egészségügyi Klinikája (UEOHC) által felügyelt egészségügyi felügyeleti terv vonatkozik, amely magában foglalja az éves orvosi vizsgálatot, az éves influenza elleni védőoltást és a CoV-fertőzéssel kapcsolatos tünetek kötelező bejelentését a BSL3-ban való munkavégzés idején. Minden BSL3-felhasználót kiképeztek az expozíció kezelésére és a jelentési protokollokra, felkészültek az önkaranténra, és képzést kaptak arra, hogy vészhelyzetben biztonságosan eljuttassák a helyi fertőző betegségekkel foglalkozó osztályra. Az EHS és az UEOHC minden lehetséges expozíciós eseményt jelent és kivizsgál, és a jelentéseket a CDC-nek és az NIH-nek is benyújtja.

Referenciák letöltése

Forrás: veteranstoday.com